Unité Mixte
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Biologie et Génétique
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Les projets de recherche

Projet/Axe1 : Etude du métabolome de X. albilineans


L’absence chez X. albilineans d’un système de sécrétion de type III Hrp implique que la sécrétion d’effecteurs de pathogénie repose sur d’autres systèmes de sécrétion.

Les petites molécules, également appelées métabolites secondaires, sont de bons candidats car elles sont sécrétées par les bactéries à l’aide de systèmes de sécrétion de type I. Ces petites molécules, qui n’utilisent que des pompes pour sortir de la bactérie et pour entrer dans la cellule végétale, pourraient être sécrétées par X. albilineans au niveau du xylème et atteindre leurs cellules cibles par diffusion.

Une fois dans la cellule végétale, ces métabolites joueraient le rôle d’effecteurs. Leur fixation à une ou plusieurs protéines de la canne à sucre empêcherait la mise en place des mécanismes de défense de la plante ou modifierait la physiologie de la cellule végétale afin de favoriser la multiplication de la bactérie dans le xylème.

Le génome de X. albilineans contient 12 gènes de grande taille codant des mégaenzymes de la famille des NRPSs (« non ribosomal peptide synthetases ») qui sont impliqués dans la biosynthèse de petites molécules. Ces 12 gènes couvrent 4% du génome.


1-1 Surproduction et caractérisation de l’albicidine

Trois des 12 gènes NRPS sont impliqués dans la biosynthèse d’une toxine particulière et spécifique qui est appelée albicidine (Figure. 2). L’albicidine est un inhibiteur puissant de l’ADN gyrase des chloroplastes, ce qui lui confère un rôle important dans l’apparition des symptômes foliaires.

Par ailleurs, l’albicidine est un puissant antibiotique qui donne un avantage sélectif à X. albilineans par rapport aux autres bactéries présentes dans le xylème de la canne à sucre. Le faible niveau de production d’albicidine chez X. albilineans a, jusqu’à ce jour, empêché la détermination de sa composition biochimique et de sa structure.

Afin de contourner ce problème, l’ensemble des gènes de biosynthèse de l’albicidine a été cloné et transféré chez X. axonopodis pv. vesicatoria, et le niveau de production de cette toxine a ainsi été optimisé.

Figure 2 : Carte physique du groupement de gènes XALB1 impliqué dans la biosynthèse de l’albicidine (Royer et al., 2004)

 

 

Ce système de surproduction hétérologue (Figure 3) a été breveté en collaboration avec l’université de Floride (Prof. Dean W. Gabriel).

Il est actuellement utilisé par notre équipe pour purifier l’albicidine et caractériser sa structure chimique en collaboration avec l’université de Berlin (Prof. R. Süssmuth) dans le cadre d’un projet franco-allemand co-financé par l’ANR (Agence Nationale de la Recherche) et la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Figure 3 : Production d’une molécule présentant les mêmes propriétés antibiotiques que l’albicidine par l’hôte hétérologue Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria.
A: Hôte hétérologue transformé avec les gènes de biosynthèse de l’albicidine
B: Hôte hétérologue transformé avec les plasmides vides (témoin non producteur)


1-2 Etude des autres effecteurs de pathogénie synthétisés par des NRPS chez X. albilineans


Des résultats préliminaires, obtenus à l’aide d’un mutant incapable d’activer les enzymes NRPS, suggèrent qu’au moins un des neuf autres gènes NRPS est impliqué dans la biosynthèse de petites molécules jouant un rôle important dans l’interaction de X. albilineans avec la canne à sucre.

Afin de caractériser la fonction et la structure chimique de ces nouvelles petites molécules, chaque gène NRPS a été inactivé par mutagenèse dirigée et différents mutants de X. albilineans ont été construits. Le criblage de ces mutants pour leur capacité à se multiplier dans la tige de canne à sucre conduira à l’identification des gènes NRPS impliqués dans la biosynthèse de petites molécules favorisant la multiplication de X. albilineans dans les vaisseaux du xylème.

En parallèle, l’analyse différentielle des surnageants de culture obtenus à partir de ces différents mutants et de la souche sauvage nous permettra :

  1. (i) d’explorer, à l’aide des outils de chimie structurale, la présence de petites molécules spécifiquement synthétisées par chacun des NRPSs ;
  2. (ii) de détecter, à l’aide d’une série de test biologiques, la présence d’une activité biologique spécifiquement liée à l’expression d’un gène NRPS (surfactant, antibiotique, antifongique, antiprolifératif, éliciteur,...).

Sur la base de cette analyse différentielle, des études plus approfondies seront développées. Celles-ci auront pour but de purifier ces petites molécules, puis d’en déterminer la structure chimique et de mieux définir leur rôle dans la multiplication de X. albilineans dans la plante hôte. Ce projet est réalisé dans le cadre du projet Franco-Allemand co-financé par l’ANR et la DFG.


Projet/Axe 2 : Etude du transcriptome de X. albilineans

La multiplication de X. albilineans dans le xylème de la canne à sucre est conditionnée à l’expression de plusieurs gènes qu’il importe d’identifier pour comprendre les mécanismes moléculaires qui confèrent à X. albilineans la pathogénie envers la canne à sucre.

Les biopuces sont couramment utilisées pour déterminer le profil global d’expression génique. Nous avons choisi cette technique pour identifier les gènes de X. albilineans exprimés in planta et pour explorer les voies de signalisation cellulaire qui sont potentiellement responsables de la régulation des gènes de pathogénie chez X. albilineans.

2-1 Etude de l’expression des gènes de X. albilineans in planta à l’aide de biopuces

Afin d’identifier les gènes spécifiquement exprimés chez X. albilineans lors de la multiplication dans le xylème, des analyses Microarray vont être réalisées avec des ARN préparés à partir de bactéries isolées du xylème de cannes à sucre inoculées avec X. albilineans.

Ce projet est réalisé en collaboration avec l’université du Wisconsin-Madison (Prof. Caitilyn Allen) et il est financé par la fondation Agropolis. Les biopuces spécifiques du transcriptome de X. albilineans ont été construites par la société NimbleGen (Madison, USA) grâce à la séquence du génome de X. albilineans. Les résultats obtenus à l’aide des biopuces seront confirmés en utilisant la technique de RT-PCR quantitative.

2-2 Exploration des voies de signalisation cellulaires chez X. albilineans à l’aide de biopuces

Chez X. fastidiosa et chez plusieurs espèces de Xanthomonas, le facteur signal diffusible DSF joue un rôle très important dans le contrôle de processus cellulaires variés impliqués dans la pathogénie (biofilms, motilité,….).

Les gènes impliqués dans la biosynthèse et la détection de ce signal sont appelés rpf pour « regulation of pathogenicity factors», et X. albilineans possède l’ensemble de ces gènes.

Afin d’identifier les gènes de X. albilineans contrôlés par le facteur DSF, des analyses Microarray vont être réalisées avec des ARNs totaux préparés à partir de mutants de X. albilineans incapables de synthétiser cette molécule. L’analyse différentielle des profils d’expression obtenus à l’aide de ces mutants et de la souche sauvage permettra d’identifier les gènes dont le niveau d’expression dépend de la production de DSF. Les résultats obtenus à l’aide des biopuces seront confirmés en utilisant la technique de RT-PCR quantitative. Des expérimentations sur canne à sucre seront alors envisagées pour mieux comprendre le rôle de cette voie de signalisation cellulaire dans la pathogénie de X. albilineans.


Projet/Axe 3 : Analyse fonctionnelle de gènes de pathogénie candidats

L'étude des mécanismes moléculaires conférant la pathogénie à X. albilineans envers la canne à sucre implique l’utilisation d’outils d’analyse fonctionnelle tels que la mutagenèse aléatoire ou la mutagenèse dirigée qui permettent de démontrer l’implication d’un gène dans une fonction donnée de la bactérie.


 
 
A
B
C
D
E
F
 

Figure 4 : Progression de la sévérité des symptômes d'échaudure de la feuille, depuis les lignes blanches foliaires jusqu'à la nécrose :

A = feuille de canne à sucre saine
B = lignes blanches
C = lignes blanches et chlorose foliaire
D = début de nécrose de la feuille
E = nécrose avancée de la feuille
F = lignes blanches + chlorose + nécrose très prononcée

 


3-1 Criblage de mutants aléatoires d’une souche très pathogène de X. albilineans pour leur capacité à se multiplier dans la canne à sucre


Mille deux cents mutants de la souche de X. albilineans XaFL07-1 originaire de Floride ont été produits par mutagenèse aléatoire du génome à l’aide du transposon Tn5. Des plants de canne à sucre ont été inoculés avec chacun de ces mutants, et 44 mutants ne produisant plus de symptômes ou n’étant pas capables de coloniser la canne à sucre ont été identifiés.

Le site d’insertion du transposon a été déterminé et les gènes mutés codent des protéines impliquées dans divers processus comme la biosynthèse de polysaccharides extracellulaires, la sécrétion, la signalisation ou le transport. Certains de ces gènes sont des gènes de pathogénie nouveaux encore non décrits chez les bactéries phytopathogènes.

Par exemple, la mutation d’un gène ompA codant une protéine de la membrane externe (« Outer Membrane Protein ») rend X. albilineans incapable d’envahir efficacement la feuille et la tige de canne à sucre, et de provoquer l’apparition de symptômes foliaires.

3-2 Analyse fonctionnelle de gènes de pathogénie identifiés chez d’autres bactéries phytopathogènes

Comme signalé ci-dessus, le facteur DSF joue un rôle très important dans la régulation des gènes de pathogénie chez les Xanthomonas et chez X. fastidiosa.

En complément de l’approche biopuce (cf. 2.2), une analyse fonctionnelle du gène de biosynthèse du DSF (rpfF) et des gènes codant pour le récepteur du DSF (rpfG et rpfC) a été entreprise. Les mutants de X. albilineans dont le gène rpfF, rpfG ou rpfC a été délété ne sont pas affectés dans la production d’albicidine in vitro. Ces mutants sont toujours capables de provoquer l’apparition de symptômes foliaires et de se multiplier dans le xylème de la canne.

En revanche, lorsque les trois gènes sont délétés dans un même mutant, celui-ci est affecté dans sa capacité à produire des symptômes et sa mobilité in vitro est réduite. Des analyses complémentaires sont en cours pour étudier plus finement ces différents mutants, notamment leur capacité à former des biofilms et à envahir le système vasculaire de la canne à sucre.

3-3 Analyse fonctionnelle de gènes candidats

Le criblage de mutants aléatoires et les études du transcriptome conduiront à l’identification de plusieurs gènes candidats potentiellement impliqués dans les mécanismes moléculaires permettant à X. albilineans de se multiplier efficacement dans les vaisseaux du xylème.

Chacun de ces gènes fera l’objet d’une étude fonctionnelle approfondie afin de mieux définir son rôle dans les Mécanismes moléculaires qui permettent à X. albilineans de s’adapter aux nutriments présents dans la sève de la canne à sucre, d’adhérer aux parois des vaisseaux du xylème de la plante hôte, d’envahir d’autres habitats que les vaisseaux du xylème ou de contourner les mécanismes de défense de la canne à sucre. Ce travail sera réalisé en collaboration avec les professeurs Dean W. Gabriel (université de Floride) et Caitilyn Allen (université du Wisconsin-Madison) qui travaillent également sur les mécanismes moléculaires permettant aux bactéries (et notamment Xylella fastidiosa et Ralstonia solanacearum) de se multiplier efficacement dans les vaisseaux du xylème.

asques et ascospores de Magnaporthe orizae - copyright : JL Notteghem spores Magnaporthe oryzae - copyright : JL Notteghem bactéries Xanthomonas pseudoalbilineans (gauche) et Xanthomonas albilineans (droite). Les deux produisent l'antibiotique albicidine (structure en haut de la photo - copyright : S. Cociancich/A. Mainz
  champignon Magnaporthe (vert) en train d'attaquer une feuille de riz - copyright : A. Delteil/JB Morel test d'anticorps sur puceron (Mysus persicae) - copyright : MS Vernerey/M. van Munster/M. Uzest